دیجیتال PCR قطره ای – Droplet Digital PCR

دیجیتال PCR قطره ای – Droplet Digital PCR

این روش برای دسترسی به دقت بسیار بالا، درون هزاران قطره با اندازه نانولیتر انجام می شود. از طریق این روش می توان تعداد دقیق نوکلئیک اسیدهای موجود در یک نمونه اولیه را به صورت کاملا دقیق به دست آورد. نمونه DNA ژنومی به حدی رقیق می شود که در درون هر قطره یک یا هیچ مولکول DNA قرار گیرد و سپس این ها با پرایمرهای PCR مخلوط می شوند، به این محلول پروب های TaqMan تشخیص دهنده آلل های متفاوت مورد بررسی (همانند روش معمولی Real-time PCR ) و واکنشگر های لازم نیز اضافه می شوند. پس از تکثیر PCR میزان فلورسانس در هر قطره اندازه گیری شده و تعداد قطره ها برای شناسایی سیگنال های مربوط به آلل های نوع وحشی و جهش یافته شمارش می شود . این تکنیک می تواند حساسیت بسیار بالایی برای شناسایی جهش های بسیار سطح پایین (جهش های بسیار نادر) مثل حالت موزائیک یا جهش های سوماتیک اکتسابی یا جهش های پدری در حالت بررسی جهش های وارثتی در DNA جنینی آزاد در خون مادر، به وجود بیاورد.


بیشترین کاربرد این تکینک تایید جهش حذفی و مضاعف شدگی شناسایی شده توسط سایر روش ها می باشد. در این روش واکنش های PCR درون هزاران قطره با اندازه های نانولیتری انجام می شود و از این طریق تعداد دقیق اسید های نوکلئیک به دست می آید. نمونه DNA ژنومی به حدی رقیق می شود که درون هر قطره یک یا هیچ مولکول DNA قرار بگیرد سپس این ها به صورت جداگانه با پرایمرهای PCR مختص ژن مورد هدف و ژن خانه دار (به عنوان ژن مرجع) مخلوط می شوند. پس از تکثیر PCR میزان فلورسانس در هر کدام از قطره ها اندازه گیری می شود و غلظت DNA هدف بر مبنای تعداد کپی در هر میکرولیتر با استفاده از نسبت واکنش های مثبت با استفاده از روش های آماری پواسون(Poisson statistics) محاسبه می شود. نرخ کپی های DNA هدف با ژن مرجع مقایسه می شود تا تخمینی از تعداد کپی های ژنی که برای بررسی دوزاژ غیر نرمال مورد ارزیابی بوده است به دست آید.

در زیر می توانید یک ویدوئو از کلی از این روش را مشاهده کنید:

 

 

 

ممکن است شما دوست داشته باشید مطالب بیشتر از این نویسنده

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

چهار × 1 =